Ανάλυση όλων των γονιδίων του ανθρώπου (Clinical Whole Exome Sequencing, WES)

Η ανάλυση της αλληλουχίας του DNA όλων των γονιδίων (Whole Exome Sequencing – WES) με τις μεθόδους ανάλυσης DNA νέας γενεάς (Next Generation Sequencing – NGS) αποτελεί το νέο γενετικό υπερ-όπλο, αφού είναι θεωρητικά σε θέση να αποκαλύψει με μεγάλο ποσοστό επιτυχίας, τη μοριακή βάση για οποιοδήποτε γενετικό νόσημα σε ένα πάσχον άτομο, στο οποίο δεν έχει διαγνωσθεί η αιτία με τις άλλες διαθέσιμες επιλογές γενετικού ελέγχου.

Η συγκεκριμένη εξέταση είναι εντελώς διαφορετική από τα άλλα είδη των μέχρι σήμερα γνωστών γενετικών εξετάσεων, όσον αφορά τον αριθμό των γονιδίων που ελέγχονται ταυτόχρονα.

Η μέχρι σήμερα κλασσική προσέγγιση για τη διάγνωση όλων των γενετικών νοσημάτων αφορούσε τη στοχευμένη διερεύνηση συγκεκριμένων γονιδίων (1-5), που εκτιμούσαμε ότι είναι δυνατό να σχετίζονται με τον παρατηρούμενο φαινότυπο.

Σήμερα πλέον, η τεχνολογία του NGS μας επιτρέπει τη μαζική ανάλυση όλων των ~22.000 γονιδίων του ανθρώπου (WES), ή ακόμα τη ταυτόχρονη ανάλυση δεκάδων κι εκατοντάδων γονιδίων (gene panels) που έχουν σχέση με διάφορες κατηγορίες νοσημάτων με γενετική αιτιολογία.

Exome = το μέρος του DNA μας που κωδικοποιεί για όλα τα γονίδια = όλες τις πρωτεΐνες.

• Περιλαμβάνει ~22.000 γονίδια, > 160.000 εξόνια,
• Καλύπτει ~40-50 Mb (40-50 εκατομμύρια βάσεις)
• Περιλαμβάνει τις περιοχές συρραφής εξονίων-ιντρονίων (splicesites)

Σήμερα, η ανάλυση WES είναι χρήσιμη έως απραίτητη:

• για την αποκάλυψη παθολογικών μεταλλάξεων, για σπάνια (ή σύνθετα) γενετικά νοσήματα, όπου οι κλασσικές προσεγγίσεις γενετικού ελέγχου (π.χ. ενός μόνο γονιδίου) δεν είναι αποτελεσματικές ή εφαρμόσιμες
• για την αποκάλυψη παθολογικών μεταλλάξεων, για κοινά γενετικά νοσήματα, π.χ. καρκίνοι, αυτισμός, νοητική υστέρηση
• για την αποκάλυψη σωματικών μεταλλάξεων, σε διάφορους ιστούς (μωσαϊκισμός)

Η ανάλυση WES δεν είναι χρήσιμη:

• για αποκάλυψη κοινών παραλλαγών-πολυμορφισμών με άγνωστες λειτουργικές συνέπειες
• για προσωπικό γενωμικό ‘προφίλ’ ή μελέτες για προδιαθέσεις-κίνδυνο για κοινά νοσήματα

Η εφαρμογή της ιδιαίτερα εξειδικευμένης αυτής εξέτασης απευθύνεται σε κλινικούς ιατρούς και τους ασθενείς τους που πάσχουν από κάποιο αδιάγνωστο μέχρι σήμερα νόσημα, που εκτιμάται ότι είναι δυνατό να έχει γενετική αιτιολογία. Αυτό δεν σημαίνει ότι πρέπει υποχρεωτικά να υπάρχει οικογενειακό ιστορικό της νόσου, αφού π.χ. στα υπολειπόμενα ή σποραδικά νοσήματα (που είναι η πλειοψηφία των γενετικών νοσημάτων), συνήθως υπάρχει ένα μόνο πάσχον μέλος.

Με βάση τα μέχρι σήμερα δεδομένα, η εφαρμογή της ανάλυσης έχει αποδειχθεί εξαιρετικά χρήσιμη για τη διάγνωση της αιτίας νευρο-αναπτυξιακών παιδιατρικών νοσημάτων, αδιευκρίνιστων συνδρόμων, αδιάγνωστων νευρογενετικών παθήσεων, αυτισμού, κ.α., ενώ έχει αποδειχθεί ιδιαίτερα πολύτιμη στην διαχείριση ογκολογικών περιστατικών-καρκίνων.

Να σημειώσουμε ότι στο βαθμό που σήμερα ακόμα δεν γνωρίζουμε την ακριβή λειτουργία όλων των γονιδίων, αλλά κι όλες τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ γονιδίων, είναι δυνατό ιδιαίτερα σε περιπτώσεις με ασαφή κλινικά χαρακτηριστικά να μην έχουμε απόλυτα επιτυχή διάγνωση.

Κατ’ αρχήν, από το δείγμα περιφερικού αίματος απομονώνεται DNA που στη συνέχεια υποβάλλεται σε διαδικασίες ελέγχου ποιότητας. Η τεχνική Ampliseq Whole Exome Sequencing και Next Generation Sequencing (NGS) που εφαρμόζουμε, στοχεύει στην ανάλυση της αλληλουχίας των βάσεων των εξονίων όλων των γνωστών γονιδίων του ανθρώπου (CCDS genes).

Στο βαθμό που η συντριπτική πλειοψηφία των παθολογικών μεταλλάξεων των γονιδίων (>90%) βρίσκονται στα εξόνια (δηλαδή, της κωδικοποιούσες περιοχές των γονιδίων), σε αντίθεση με μεταλλάξεις στα ιντρόνια ή σε άλλες ρυθμιστικές περιοχές (δηλαδή, της μη-κωδικοποιούσες περιοχές των γονιδίων) που είναι πολύ λιγότερες, η ανάγνωση της αλληλουχίας των βάσεων όλων των εξονίων του ανθρώπινου γονιδιώματος (whole exome sequencing), παρέχει τη δυνατότητα να αποκαλυφθούν μαζικά μεταλλάξεις σε γονίδια που ευθύνονται για γενετικά νοσήματα.

Πρέπει όμως να σημειωθεί ότι η τεχνική, όπως εφαρμόζεται σήμερα, έχει τη δυνατότητα πρακτικά να αποτυπώσει με επιτυχία την αλληλουχία των βάσεων, σε σχέση με το Reference Genome (NCBI hg19), σε ποσοστό ~95% των εξονίων (CCDS). Επίσης, το βάθος ανάγνωσης (δηλαδή, ο αριθμός κάλυψης/ανάγνωσης της κάθε βάσης (depth of sequence coverage) δεν είναι ίδιο για όλες τις περιοχές, με αποτέλεσμα ορισμένες περιοχές του γονιδιώματος να έχουν σχετικά μεγαλύτερη πληρότητα κάλυψης κι ακρίβεια ανάγνωσης.

Η χαρτογράφηση των βάσεων γίνεται με τη βοήθεια ειδικών λογισμικών, ενώ η ταυτοποίηση και ιεράρχηση των μεταλλάξεων (variant analysis and prioritization pipeline) επιτυγχάνεται με το ειδικό λογισμικό Exome Management Application (EMA^®) που έχουμε αναπτύξει ειδικά για το σκοπό αυτό. Χρησιμοποιούμε πολλά άλλα ειδικά εργαλεία και βάσεις δεδομένων αναφοράς, συμπεριλαμβανομένης και εσωτερικής βάσης δεδομένων συχνότητας γενωμικών αλλαγών/μεταλλάξεων (Local Variant Database) από Whole Exome Sequencing σε ~120 άτομα του Ελληνικού πληθυσμού.

Τέλος, στην παρούσα εξέταση γενικά αξιολογούνται κι αναφέρονται μόνο:

• γνωστές παθολογικές μεταλλάξεις (known pathogenic mutations), που έχουν προηγούμενα αναφερθεί σε πάσχοντες και είναι γνωστό ότι συνδέονται με την εκδήλωση της νόσου, και
• νέες ‘υποχρεωτικά παθολογικές’ αλλαγές/μεταλλάξεις (obligatory pathogenic), που εμπίπτουν στις κατηγορίες nonsense, frameshift, canonical splice-site variants, indels.

Σε ορισμένες επιλεγμένες περιπτώσεις, είναι δυνατό να αξιολογηθούν και να αναφερθούν αλλαγές/μεταλλάξεις που δεν εμπίπτουν στις παραπάνω δυο κατηγορίες.

Η συγκεκριμένη μεθοδολογία και τεχνική έχει ορισμένους περιορισμούς:

• Δεν είναι σε θέση να αποκαλύψει αλλαγές (variants) σε ‘τυφλά σημεία’ των εξονίων, που είτε δεν αναλύθηκαν στο συγκεκριμένο δείγμα (συνήθως <10%) ή που δεν είναι γενικά σε θέση αναλυθούν με την εφαρμοζόμενη τεχνολογία (π.χ. GC-rich περιοχές, κ.α.).
• Δεν είναι σε θέση να αποκαλύψει εκτεταμένες ελλείψεις/διπλασιασμούς (copy number variants).
• Επίσης, δεν είναι σε θέση να διαγνώσει μια κατηγορία γενετικών νοσημάτων, που οφείλονται σε επέκταση του αριθμού επαναλήψεων βάσεων (όπως triplet-repeat disorders).
• Η αξιολόγηση ακολουθεί τις συστάσεις του ACMG (Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 2015;17:405-24).

Η εξέταση τυπικά ολοκληρώνεται σε 4-6 εβδομάδες, αλλά ο χρόνος εξαρτάται από το κάθε περιστατικό και τη κλινική εικόνα.

Η εξέταση είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη και σύνθετη, επομένως είναι απαραίτητο τα αποτελέσματα να εκτιμηθούν από εξειδικευμένη ομάδα κλινικών και μοριακών γενετιστών, που εγγυάται τη μέγιστη δυνατή ασφάλειά σας.

Η σωστή κλινική γενετική εκτίμηση του περιστατικού και η γενετική συμβουλή, τόσο πριν όσο και μετά την εξέταση, είναι απαραίτητη προϋπόθεση, ώστε να καθορισθεί η σωστή στρατηγική του εργαστηριακού ελέγχου και να μπορέσουν να αποδοθούν σωστά οι έννοιες του πάσχοντος και του φυσιολογικού.